1. Akt
Kirche von Sant’ Andrea della Valle in Rom, 17. Juni 1800: Der politische Gefangene Angelotti versteckt sich in der Kirche, in der sein Freund, der Maler Mario Cavaradossi gerade ein Marienbild fertig stellt. Der Messner behauptet, das Bild ähnelt einer der Frauen, die zum Beten regelmäßig in die Kirche komme. Mario malt tatsächlich die Gesichtszüge des Bildes wie die seiner großen Liebe Tosca. Angelotti kommt aus seinem Versteck, und Mario will ihm helfen. Als die Sängerin Floria Tosca die Kirche betritt, versteckt sich Angelotti erneut. Im Bild der Maria erkennt die Primadonna eine Ähnlichkeit mit der Gräfin Attavanti, Angelottis Schwester. Cavaradossi überzeugt sie aber von seiner Liebe und mildert ihre Eifersucht.
Kanonenschüsse sind zu hören. Angelottis Flucht wurde entdeckt und Cavaradossi bietet ihm seinen Garten als Versteck an. Der Polizeichef Scarpia betritt die Kirche und bemerkt sofort den Korb mit Essen, den Mario für Angelotti hingestellt hat. Außerdem findet Scarpia einen Fächer. Er behauptet gegenüber Tosca, dies sei der Fächer der Gräfin aus dem Bild, mit der der Maler eine Affäre habe. Schluchzend verlässt Tosca die Kirche, in der jetzt ein Te Deum anlässlich des Sieges über Napoleon gefeiert wird. Scarpia schwört unterdessen, die Liebe Toscas zu erobern.
2. Akt
Palazzo Farnese, Scarpias Zimmer in einem oberen Stockwerk am selben Abend: Scarpia will sich Tosca zu eigen machen. Seine Diener holen Cavaradossi und bringen ihn genau in dem Moment herein, als auch Tosca kommt. Der Polizeichef befiehlt, Cavaradossi foltern zu lassen, bis er das Versteck des geflohenen Angelotti verrät. Tosca ist erschüttert und verrät nun selbst das Versteck. Darüber ist Cavaradossi empört, zeigt aber, dass er sich über die falsche Nachricht vom Sieg über Napoleon freut. Daraufhin ordnet Scarpia seine Exekution an. Nur wenn Tosca sich mit Scarpia einlässt, wird der geliebte Maler verschont.
Kurz darauf stellt sich heraus, dass sich Angelotti umgebracht hat, um der Gefangenschaft zu entgehen. Trotzdem bleibt Scarpia bei seiner erpresserischen Methode, um Tosca zu erobern. Er will eine Scheinhinrichtung organisieren, Cavaradossi aber anschließend freilassen. Als sich Scarpia schließlich Tosca nähert, ersticht sie ihn.
Sie stellt Kerzen neben dem toten Scarpia auf, legt ein Kreuz auf seine Brust und geht.
3. Akt
Auf der Engelsburg gegen 5 Uhr am 18. Juni 1800. Die Hinrichtung von Cavaradossi soll in einer Stunde stattfinden. Er denkt an Tosca, die wenig später erscheint und berichtet, dass sie Scarpia getötet hat und ihm nur eine Scheinhinrichtung bevorstehe. Er solle wie in einem Theaterstück mitspielen und sich nach den Schüssen fallen lassen. Die Hinrichtung folgt – Tosca sagt ihm, er solle noch liegenbleiben, merkt dann aber, dass ihr Freund wirklich tot ist. Scarpia hat sich nun endgültig gerächt und Mario wirklich töten lassen. Bevor der Polizeiagent Spoletta sie wirklich verhaften kann, springt sie von der Engelsburg herunter in den Tod.
Hier also nun der angekündigte Mitschnitt aus der Wiener Staatsoper: